Determinazione de novo delle strutture Cry11Aa e Cry11Ba zanzaracide da fonti naturali
Nature Communications volume 13, numero articolo: 4376 (2022) Citare questo articolo
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Cry11Aa e Cry11Ba sono le due tossine più potenti prodotte dal zanzaricida Bacillus thuringiensis subsp. israelensis e jegathesan, rispettivamente. Le tossine cristallizzano naturalmente all'interno dell'ospite; tuttavia, i cristalli sono troppo piccoli per la determinazione della struttura nelle sorgenti di sincrotrone. Pertanto, abbiamo applicato la cristallografia seriale a femtosecondi ai laser a elettroni liberi a raggi X ai nanocristalli cresciuti in vivo di queste tossine. La struttura di Cry11Aa è stata determinata de novo utilizzando il metodo di dispersione anomala a lunghezza d'onda singola, che a sua volta ha consentito la determinazione della struttura di Cry11Ba mediante sostituzione molecolare. Le due strutture rivelano un nuovo modello per la cristallizzazione in vivo delle tossine Cry, per cui ciascuno dei loro tre domini si impacca con un dominio simmetricamente identico e un motivo di impaccamento cristallino scindibile si trova all'interno della protossina anziché alle estremità. La diversità dei modelli di cristallizzazione in vivo suggerisce spiegazioni per i loro vari livelli di tossicità e approcci razionali per migliorare queste tossine per il controllo delle zanzare.
Gli insetticidi biologici più comunemente utilizzati per il controllo delle popolazioni di vettori di zanzare e simulidi sono prodotti dal batterio Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), scoperto in Israele nel 19761. Questi prodotti colpiscono lo stadio larvale di un'ampia varietà di vettori e, grazie alla loro elevata efficacia e sicurezza ambientale, hanno sostituito gli insetticidi chimici sintetici ad ampio spettro in molti programmi di controllo dei vettori. Questi includono Anopheles gambiae e specie affini che trasmettono la malaria, nonché numerose specie Culex e Aedes che diffondono virus come quelli che causano l'encefalite del Nilo occidentale e la febbre gialla. I prodotti Bti sono utilizzati anche in Africa per controllare le specie di mosche nere responsabili del trasporto delle filarie che causano la cecità fluviale. A parte le popolazioni di vettori, vengono utilizzati per controllare le fastidiose zanzare nella valle del Reno in Germania, nella Camargue nel sud della Francia e in tutti gli Stati Uniti, in Asia, America Latina e Sud America, con migliaia di tonnellate applicate negli ultimi 30 anni.
L'attività zanzaracida altamente potente di Bti è dovuta a tre forme nanocristalline di quattro protossine, vale a dire. Cyt1Aa, Cry11Aa e Cry4Aa e Cry4Ba co-cristallizzati. Questi vengono prodotti durante la sporulazione e sono notevolmente stabili in una varietà di condizioni, ma si dissolvono dopo l'ingestione agli elevati livelli di pH alcalino caratteristici dell'intestino medio della zanzara larvale2. Le protossine solubilizzate vengono attivate dalle proteasi intestinali degli insetti che consentono il legame con le membrane delle cellule intestinali, la successiva oligomerizzazione e, infine, la lisi delle cellule intestinali che porta alla morte delle larve2. Le tossine Bti sono sicure per l’ambiente perché sono molto più specifiche per le zanzare bersaglio rispetto ai larvicidi chimici ad ampio spettro.
La più potente delle quattro tossine Bti è Cry11Aa, ma la sua attivazione e il meccanismo di tossicità sono poco conosciuti, in gran parte perché a differenza di Cry4Aa, Cry4Ba e Cyt1Aa, la sua struttura è sconosciuta. Una tossina correlata prodotta da Bt subsp. jegathesan (Btj) è Cry11Ba, che è da sette a trentasette volte più tossico di Cry11Aa contro le principali specie di zanzare vettori appartenenti ai generi Aedes, Anopheles e Culex3, e in alcuni ospiti batterici sembra formare cristalli leggermente più grandi. Anche la struttura di Cry11Ba è sconosciuta, sebbene sia stato utilizzato come sostituto di Cry11Aa in ceppi ricombinanti di Bti per migliorare significativamente l'attività zanzaracida3,4. Pertanto, il nostro obiettivo era determinare le strutture delle protossine Cry11Aa e Cry11Ba per aiutare a capire come ottengono la formazione di cristalli robusti labili solo a pH alcalino e ottenere approfondimenti strutturali per aumentare l'efficacia di queste proteine per il controllo delle zanzare.
La determinazione della struttura delle protossine Cry11Aa e Cry11Ba da nanocristalli naturali richiede una tecnologia all'avanguardia. La cristallografia convenzionale è limitata a progetti in cui i cristalli sono sufficientemente grandi da montare e oscillare individualmente in un fascio di raggi X di sincrotrone. In passato, i cristalli di Cry4Aa5, Cry4Ba6 e Cyt1Aa7 attivati raggiungevano dimensioni sufficienti coltivandoli in vitro da tossine disciolte da nanocristalli naturali e attivando le tossine enzimaticamente. Tuttavia, Cry11Aa e Cry11Ba non si ricristallizzano in vitro da nanocristalli disciolti8. Inoltre, l'attivazione enzimatica è indesiderata poiché il nostro obiettivo è comprendere il meccanismo controllato dal pH della dissoluzione dei cristalli naturali. Per osservare lo stato della protossina nei nanocristalli naturali prodotti nelle cellule batteriche, abbiamo applicato la cristallografia seriale a femtosecondi (SFX) ai laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL)9,10,11. Nell'esperimento SFX, gli impulsi del fascio XFEL ad alta brillantezza, ciascuno della durata di soli ~10–50 fs, intercettano una serie di nanocristalli, un impulso per cristallo, suscitando il segnale di diffrazione più forte possibile da ciascun minuscolo cristallo prima che vaporizzi e producendo un serie di istantanee di diffrazione, successivamente assemblate in un set di dati completo. La fattibilità di questa strategia è stata dimostrata dalla recente delucidazione dell'intera cascata di bioattivazione di Cyt1Aa12.